伯樂CFX DUET實時熒光定量PCR儀的操作使用方法。這是一款非常經(jīng)典和用戶友好的qPCR儀器，其操作流程主要分為實驗準備、軟件設(shè)置、運行儀器和數(shù)據(jù)分析四個部分。

一、伯樂CFX DUET實時熒光定量pCR儀軟件設(shè)置 - 創(chuàng)建并運行一個實驗

在CFX Maestro軟件主界面，點擊 “新建實驗"。

1、步驟1：設(shè)置實驗類型和檢測染料

（1）實驗類型：選擇 “定量PCR"。

（2）檢測模式：

探針法：如果您使用了TaqMan探針等，選擇 FAM 或其他對應(yīng)熒光基團。

染料法：如果您使用了SYBR Green I等染料，選擇 SYBR。

您也可以在一個實驗中同時設(shè)置多種檢測模式（例如，一部分孔用FAM，另一部分用HEX/VIC/JOE），這就是“DUET"名稱的由來，支持雙色檢測。

2、步驟2：設(shè)置板布局

軟件界面會顯示一個虛擬的96孔板圖。

（1）指定樣品類型：

未知樣品：您的待測樣本。

陽性對照：已知含有目標序列的樣品。

陰性對照：不含模板的樣品（如用水代替），用于檢測是否有污染。

標準品：用于制作標準曲線。您需要輸入每個標準品的已知濃度。

（2）指定目標基因：為每個孔或每組孔指定檢測的基因名稱（例如，GeneA， ActB）。

（3）指定熒光染料：為每個孔或每組孔指定所使用的熒光通道（如FAM， SYBR）。

3、步驟3：設(shè)置反應(yīng)程序

這是qPCR反應(yīng)的核心步驟，通常包括三個階段：

（1）酶激活步驟（可選，取決于預(yù)混液）：

溫度：95 °C

時間：2-10 分鐘

循環(huán)數(shù)：1

（2）擴增循環(huán)（PCR循環(huán)） - 重復(fù)運行40-45個循環(huán)：

變性：

溫度：95 °C

時間：10-30 秒

退火/延伸：

溫度：55-65 °C（根據(jù)您的引物TM值優(yōu)化）

時間：30-60 秒

在此步驟末采集熒光信號。

（3）熔解曲線分析（僅適用于SYBR Green染料法）：

程序會自動添加。通常是從65°C緩慢升溫到95°C，在此過程中連續(xù)采集熒光信號，用于確認擴增產(chǎn)物的特異性。

（4）步驟4：開始運行

檢查所有設(shè)置無誤后，點擊右上角的 “開始運行" 按鈕。

系統(tǒng)會彈出對話框，讓您輸入實驗名稱并選擇保存位置。

確認后，儀器將開始運行程序。您可以在軟件界面上實時查看反應(yīng)進程、熒光信號增長曲線和溫度變化。

二、伯樂CFX DUET實時熒光定量PCR儀運行后數(shù)據(jù)分析

1、查看擴增曲線：

軟件會自動設(shè)置基線閾值和Ct值。您可以檢查擴增曲線是否平滑，S形曲線是否典型。

2、查看熔解曲線（僅SYBR Green法）：

確認每個樣品只有一個單一的尖峰。如果出現(xiàn)多個峰，可能意味著有引物二聚體或非特異性擴增。

3、結(jié)果分析：

相對定量（常用方法）：使用 ΔΔCt法 計算基因的相對表達量。您需要指定內(nèi)參基因和對照組。

定量：如果您使用了標準品，軟件會自動生成標準曲線，并根據(jù)曲線計算出每個未知樣品的絕對拷貝數(shù)或濃度。

4、導(dǎo)出數(shù)據(jù)：您可以將結(jié)果（包括圖表和數(shù)據(jù)表格）導(dǎo)出為PDF或Excel文件，用于報告和進一步處理。

三、重要注意事項與日常維護

1、安全重要性：在運行前確保板子或管子已密封，防止生物污染。

2、保持清潔：定期用蘸有70%乙醇的無塵紙擦拭樣品槽的表面，防止灰塵或污染物影響光學(xué)系統(tǒng)。

3、避免強光直射：將儀器放置在穩(wěn)定、無振動、遠離強光源和磁場的地方。

4、軟件熟悉：花些時間熟悉CFX Maestro軟件的各個功能，它非常強大且直觀。

5、預(yù)混液說明書：不同廠家的qPCR預(yù)混液推薦的反應(yīng)程序可能略有不同，請以您所用試劑的說明書為準進行微調(diào)。

開機 → 打開CFX Maestro → 新建實驗 → 設(shè)置檢測染料 → 設(shè)置板布局（指定樣品、基因）→ 設(shè)置反應(yīng)程序（激活、變性、退火/延伸、熔解曲線）→ 保存并開始運行 → 分析數(shù)據(jù)（擴增曲線、熔解曲線、定量）→ 導(dǎo)出報告