伯樂（Bio-Rad）CFX Opus Deepwell實時熒光定量PCR儀的操作方法。這是一套標準、通用的操作流程，適用于大多數實驗。請務必始終參考您實驗室的具體SOP（標準操作程序）和試劑盒說明書，因為不同實驗的細節可能有所不同。

一、CFX Opus DeepWell實時熒光定量PCR儀操作步驟詳解

整個操作流程可以概括為以下四個主要階段，CFX Maestro軟件也基本按照這個邏輯引導用戶：

1、創建實驗方案

（1）在CFX Maestro主界面，點擊 “新建實驗" 或 “創建新實驗"。

（2）設定實驗類型： 選擇“定量PCR"。

（3）編輯實驗方案：

反應體積： 輸入您的反應體系總體積（例如 20 µL）。

孵育溫度：

預變性： 通常為95°C，持續30秒到3分鐘（根據預混液說明書推薦）。

PCR循環（擴增）：

變性： 通常是95°C，持續10-15秒。

退火/延伸： 通常是60°C，持續30-60秒。在此步驟收集熒光信號。循環次數通常設為40-45個循環。

熔解曲線（可選）： 如果您的實驗需要（例如使用SYBR Green染料），勾選此選項。儀器會在PCR結束后自動運行熔解曲線程序，通常從65°C緩慢升溫到95°C，并持續監測熒光變化。

（4）選擇熒光染料/探針：

點擊“檢測"或“通道"設置。

根據您使用的熒光物質，選擇相應的檢測通道（例如，FAM, HEX/VIC, ROX, Cy5等）。ROX通常被用作參考染料，用于校正孔間誤差。

為每個通道指定其檢測的目標基因。

（5）保存此方案，可以為其命名以便后續調用。

2、第二步：設置板布局

（1）軟件會顯示一個虛擬的96孔板界面。

（2）分配樣品和目標：

用鼠標選中孔或一個區域，然后在右側面板進行設置。

樣品類型： 為每個孔選擇“未知"、“標準品"、“陽性對照"或“陰性對照"。

目標： 從下拉菜單中選擇該孔檢測的基因名稱（對應之前設置的熒光通道）。

樣品名稱： 輸入有意義的名稱以便識別（例如，“Patient_1"， “Std_1e6"）。

對于標準品，您需要輸入準確的初始模板濃度（例如，1,000,000 copies/µL），軟件將根據這些點自動生成標準曲線。

（3）完成所有孔的設置后，板布局會以顏色和文字清晰顯示。

3、第三步：運行前準備與上樣

（1）準備反應體系：

在超凈工作臺或冰上，按照您的實驗方案配制qPCR反應混合液。通常是將預混液、引物/探針、水和模板DNA/cDNA混合。

重要： 避免產生氣泡，氣泡會干擾光路和熒光信號。

將配制好的反應液分裝到qPCR反應板的各個孔中。

（2）封板：

使用光學封板膜覆蓋板面。確保封板膜平整、緊密地貼在板子上，沒有褶皺和氣泡。這是防止蒸發和污染的關鍵步驟。

（3）上樣：

輕輕將反應板放入CFX Opus儀器的樣品槽中。

注意方向： 確保板的A1孔位于儀器的左前方（通常有角標或圖示指示）。

關閉儀器門，聽到鎖扣聲確保關緊。

4、第四步：啟動運行

回到CFX Maestro軟件界面，檢查所有設置無誤。

點擊 “開始運行" 按鈕。

軟件會彈出一個最終確認對話框，顯示預計運行時間。確認后，點擊“開始"。

儀器將開始運行您設定的溫控程序，并實時采集熒光數據。您可以在軟件界面上實時查看擴增曲線和熒光信號的變化。

二、CFX Opus DeepWell實時熒光定量PCR儀運行后數據分析

1、查看結果：

（1）擴增曲線圖： 查看所有孔的擴增曲線是否正常（S型曲線），陰性對照有無擴增。

（2）標準曲線： 如果設置了標準品，軟件會自動給出標準曲線，并顯示其斜率、效率和R2值。理想的斜率在-3.3左右，效率接近100%，R2 > 0.99。

（3）Ct值： 軟件會為每個孔計算Ct值（閾值循環數）。

（4）熔解曲線（如果運行了）： 查看熔解峰是否單一，以確認SYBR Green實驗的特異性。

2、數據導出：

您可以將Ct值、濃度結果、擴增曲線圖等導出為Excel或PDF格式，用于進一步處理和報告撰寫。

三、重要注意事項

1、安全重要性： 在清潔或發生泄漏時，請務必關閉儀器電源并拔掉插頭。

2、防污染： 始終使用帶濾芯的吸頭，并在專門區域配制反應體系，以防止氣溶膠污染。

3、規范操作： 操作光學封板膜和反應板時，請佩戴手套，避免用手直接接觸表面，以免影響光學讀數。

4、儀器維護： 定期根據手冊對儀器進行清潔和維護。如果樣品發生泄漏，必須立即清潔樣品槽。

5、尋求幫助： 如果遇到任何儀器報警或異常結果，請首先參考用戶手冊，或聯系伯樂的技術支持。